利用點(diǎn)成LUNA-FX7™自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀優(yōu)化精子細(xì)胞評(píng)估

關(guān)鍵詞： 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、基于圖像的精子細(xì)胞評(píng)估、細(xì)胞計(jì)數(shù)、存活率評(píng)估、雙重染色

1 引言

       精子細(xì)胞評(píng)估（又稱精液分析），在判斷男性生育潛力方面發(fā)揮著重要作用。雖然它并非直接衡量生育能力的指標(biāo)，但男性生育能力對(duì)人類生育和畜牧業(yè)育種均具有重要影響，因此精子細(xì)胞評(píng)估備受關(guān)注。

       目前，可通過流式細(xì)胞術(shù)和基于圖像的分析工具進(jìn)行精子細(xì)胞評(píng)估。點(diǎn)成LUNA-FX7™自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀等自動(dòng)化設(shè)備可利用圖像快速、便捷地分析精子樣本。然而，由于精子細(xì)胞相較于哺乳動(dòng)物細(xì)胞在形態(tài)和特性上的獨(dú)特性，因此需要優(yōu)化分析參數(shù)并選擇合適的染料。

本研究對(duì)SYBR14、吖啶橙（AO）和碘化丙啶（PI）等熒光染料進(jìn)行了比較分析，以優(yōu)化點(diǎn)成LUNA-FX7™對(duì)精子細(xì)胞的評(píng)估能力。本研究旨在評(píng)估不同染料組合的有效性，并優(yōu)化精子細(xì)胞評(píng)估的參數(shù)設(shè)置。

2 方法與材料

2.1 樣本制備

       解凍牛的冷凍精液樣本，并用PBS替換緩沖液。根據(jù)樣本情況，將精液樣本以約1:20至1:40的比例稀釋于PBS中。

2.2 熒光染色

1. 混合：

     18 μL PBS中的精子細(xì)胞

       2 μL混合的綠色和紅色熒光染料

2. 在37℃孵育10分鐘

3. 將樣本加載至合適的載玻片

4. 使用點(diǎn)成LUNA-FX7™進(jìn)行分析

表1. 點(diǎn)成LUNA-FX7™高級(jí)模式下精子細(xì)胞評(píng)估的優(yōu)化參數(shù)設(shè)置

3 優(yōu)化精子細(xì)胞評(píng)估的細(xì)胞計(jì)數(shù)方案和染料組合

總結(jié)：SYBR14/PI 與 AO/PI 雙重染色均適用于精子活力評(píng)估，但 SYBR14/PI 表現(xiàn)更優(yōu)。

        點(diǎn)成LUNA-FX7™的默認(rèn)協(xié)議已針對(duì)常見哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)化，但精子細(xì)胞評(píng)估需要調(diào)整曝光水平、細(xì)胞尺寸和去團(tuán)聚靈敏度等參數(shù)。例如，將最小搜索尺寸從3 µm調(diào)整為7 µm，并將去團(tuán)聚靈敏度從5調(diào)整為7，以提高檢測(cè)性能（表1）。此外，SYBR14/PI和AO/PI染色的曝光水平分別設(shè)定為GF 6和RF 9。

        在此基礎(chǔ)上，我們對(duì)SYBR14/PI和AO/PI染色方法進(jìn)行了比較分析。鑒于SYBR14/PI染色法在精子細(xì)胞評(píng)估中的已知有效性，我們關(guān)注AO/PI染色法的表現(xiàn)。研究結(jié)果表明，兩種染色方法均可用于精子細(xì)胞評(píng)估（圖1）。然而，SYBR14在精子細(xì)胞染色中的適用性優(yōu)于AO，表明SYBR14的化學(xué)特性可能更適合這一應(yīng)用。

圖1. 用兩種不同染料（SYBR14/PI和AO/PI）染色的精子細(xì)胞的熒光圖像。該組合圖像展示了分析后的明場(chǎng)、綠光、紅光和標(biāo)記圖像。標(biāo)記圖像為復(fù)合熒光通道圖像，其中紅色圓圈表示死亡細(xì)胞，綠色圓圈表示存活細(xì)胞。

4 結(jié)論

       本研究發(fā)現(xiàn)，SYBR14/PI和AO/PI染色法均可用于評(píng)估精子細(xì)胞存活率，但SYBR14/PI的表現(xiàn)更優(yōu)。此外，曝光水平及其他參數(shù)的調(diào)整對(duì)整體檢測(cè)性能至關(guān)重要。盡管點(diǎn)成LUNA-FX7™并非專門針對(duì)精子樣本優(yōu)化，但通過推薦的樣本稀釋比例和成像條件優(yōu)化，它仍可提供快速、便捷的精子細(xì)胞評(píng)估方案。